ELISA在猪蓝耳病抗体上的检测
来源：中国蓝耳病网 2021-12-08 16:48:24| 查看：
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猪繁殖与呼吸系统综合征( Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS) 俗称猪蓝耳病，是由猪生殖和呼吸系统综合征病毒( PRRSV) 引起以母猪发热、厌食和流产、死产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的一种疾病[1]。PRRSV属于动脉炎病毒科（Arteriviridae ）动脉炎病毒属（Arterivirus），病毒粒子有囊膜，PRRSV病毒粒子直径约为45～80nm，核衣壳为等轴对称的20面体，直径约为25～30nm，PRRSV是一种动脉炎病毒，基因组是正链、单股、线状RNA，长约15kb，是四种动脉炎病毒成员中最大的。病毒粒子表面有纤突，用乙醚和氯仿等脂溶剂处理可灭活病毒，证明PRR—SV有囊膜[2]。该病于 1987年首次在北美发现，之后在世界范围内迅速传播，我国于1996 年首次分离到该病毒[3]，最近几年PRRSV也已成为我国重要的猪传染病病原之一。自2006年6月起，在我国大范围的爆发高致病性蓝耳病，该病的出现和流行给我国的养猪业造成了巨大的经济损失，一些严重爆发的地区猪的总量下降60% ，而一些中型和小型的养猪场则因此被迫关闭。据估计，有超过6000万头的猪在这场疫病暴发中死亡和销毁，造成对养猪业的巨大恐慌[4]。此病不分年龄和季节，各龄猪均可发生，一般流行期为70～100天。在同一猪场里爆发此病停息后，容易再次爆发，且发病率显著提高，可见其免疫力低，病毒活力很强。此病只感染猪，不感染人和其他动物，蓝耳病的与仔猪的迁移运输有密切的关系。在从临陆床样品中分离病毒时，常温25℃以下病毒在血清中可维持其活力，但在组织中失活较快。PRRSV在低温下较稳定，在4℃以上则逐渐失去感染性，4℃1个月，20℃6天，37℃10-20h，在一70℃条件下病毒的感染性可保存4个月以上不变。该病毒在pH5—7之间保持稳定，当pH小于5或大于7的条件下，病毒的感染滴度降低90％以上[5]。PRRSV对多种动物的红细胞无凝集特性，不凝集猪、牛、绵羊、山羊、兔、鸡、鸭、豚鼠、小白鼠和人0型红细胞。目前对该病尚无有效的治疗方法，疫苗免疫是其主要防控手段。疫苗免疫效果的好坏直接关系到猪蓝耳病的防控效果[6]。本试验利用IDEXX PRRS X3抗体检测试剂盒[7]检测猪场猪群体内是否被PRRS病毒所感染，为检测和预防提供一定的科学依据。
ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法[8]。
1 材料和方法
1.1材料与试剂
连生牧业养殖场饲养的发生疑似猪蓝耳临床症状的猪仔,共20个样；蓝耳病抗体检测试剂盒均有北京爱德士元亨生物科技有限公司提供。
1.2仪器
精确的单道移液器和多道移液器、500ml量筒、酶标仪、恒温培养箱96孔u型板、200μL枪头、15mL离心管、加样槽
1.3方法
取出抗原包被板，标记样品号以及在记录表上记录样本的位置。首先加入100ul没有稀释的阴阳性对照，每个对照加俩个孔，一般将对照试剂分别加入96孔板的头俩孔和最后俩个孔里。在与样品号相对的孔内加入100ul已经稀释好的样品，然后将96孔板放置在25℃的温箱内孵育30分钟。取出96孔板，将液体弃入废液筒内，并用吸纸吸干残留的液体。用已经稀释好的洗涤液洗涤板孔，大约300ul每孔，洗涤3-5次即可。每次洗涤后将废弃液到入废液筒内，同时注意：避免包被孔的干燥，而且，每次都必须将残留的液体吸干。向每个孔里加入100ul酶标抗体，然后置于25℃的温箱中孵育30分钟。取出后重复洗涤并孵育一次。之后，将96孔板每孔加入100ulTMB底物液，在温箱中放置15分钟。然后倒出每孔的液体，在每孔加入100ul终止液，终止反应。用96孔酶标仪测量并且记录样本和对照的吸光度A（650）。读数并记录结果。
1.4判断标准
按照猪蓝耳病 ELISA 检测试剂盒使用说明，对被检血清进行检测。
结果判定计算方法：阴性对照平均值 NC=（NC1+NC2）/ 2；
阳性对照平均值 PC=（PC1+PC2）/ 2；
样本的计算 S/P=（样本A650-NC）/（PC-NC）
结果判定标准: PRRS抗体的有无( 阳性/阴性) 通过计算每个样品的阳性/阴性对照(S/P) 的比值进行判定。如果S/P值低于0.4，检测样品血清应判定为PRRS抗体阴性。如果S/P值大于或等于0.4，检测样品血清应判定为 PRRS 抗体阳性[9]。
2 结果与分析
连生牧业养殖场20头猪的检测结果以及抗体阴阳性分布表见表1、表2。
表1结果显示，部分S/P值大于或等于0.4，说明该猪场的猪群曾经都不同程度的被PRRSV所感染过。
表2结果显示，此次猪蓝耳病血清抗体检测研究中80%的猪检测结果为抗体阳性，说明猪场的猪群被PRRSV感染的，要求猪场要注重猪群的免疫和防护。
3 结论
本试验采用的北京爱德士元亨生物科技有限公司提供ELISA试剂盒，具有灵敏性高、特异性强、稳定性良好等特点，使检测结果更加准确，真实地反映出猪蓝耳抗体水平的高低。酶联免疫吸附试验操作简便，无需特殊的仪器设备，有高度的灵活性和敏感性；在室温下稳定；反应产物易于显现；能商品化生产，并且使检测结果更加准确，真实地反映出猪蓝耳抗体水平的高低，为快速准确的检测猪蓝耳病毒提供了可靠的工具。
通过检测可得知该牧场对猪进行了猪蓝耳病的免疫，免疫效果总体良好，只发现疑似感染20例。在可疑样本的中，80%的猪样品检测结果为抗体阳性。说明猪场的猪群部分已被PRRSV感染。可见该牧场免疫效果参差不齐，也说明疫苗可以有效的预防本病的发生。
高致病性猪蓝耳病是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。因此，养猪业应时刻保持对猪蓝耳病的高度警惕，尤其是较小规模的养殖场更应该高度重视蓝耳病的防控工作，适时接种疫苗，建立个性化猪蓝耳病疫苗免疫程序，并在接种免疫前后期间适当添加黄芪多糖类药物，以增加猪群抗病能力和免疫效果，保障养猪生产安全健康发展。平时加强免疫效果的监测工作，配合加强日常饲养管理，引种或补栏检疫，生物安全控制，及合理安排消毒工作，是当前猪场防制猪蓝耳病的有效方法。对于它的防治必须要制定合理的免疫程序，及时做好猪瘟、高致病性猪蓝耳病等动物疫病的免疫。
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