摘要
为评价猪场常用的不同采样工具对非洲猪瘟病毒核酸的释放能力，基于规模化猪场栏舍、车辆、食材、物资等不同物品采样场景，将非洲猪瘟假病毒标准物质分别添加到维特康采样专用全棉湿巾与医用纱布中，通过荧光定量PCR检测病毒核酸来评估维特康采样专用全棉湿巾对病毒的释放效果。结果显示：采样专用全棉湿巾能够对高浓度与低浓度的非洲猪瘟假病毒均具有良好的病毒释放效果。本研究评价了采样专用全棉湿巾对非洲猪瘟假病毒的释放效果，可为采样专用全棉湿巾在非洲猪瘟防控中的采样监控起指导作用。
引言
在非洲猪瘟临床防控中，非洲猪瘟的实验室检测至关重要，精准、快速的检测结果对非洲猪瘟的风险消杀、早期发现、快速处置及后期复产均提供了科学指导。非洲猪瘟的日常监测与处置过程，除对猪只采样外，还需要对人员、物资、环境采样监控。
目前，猪场对于人员、物资、环境的采样，主要使用纱布浸润生理盐水后擦拭采样。商品化小包装、单片医用纱布成本高，大多采购大块医用全棉纱布使用，需要员工提前裁剪、分装到自封袋中，然后加上生理盐水浸润。纱布在分装过程中容易造成纱布的污染，尤其是非洲猪瘟紧急处置中的猪场，一旦污染采样纱布污染，会导致错误的临床判断，导致大面积的错误扑杀。
为评价采样专用全棉湿巾对ASFV的释放效果，本研究拟采用荧光定量PCR方法检测全棉湿巾对ASFV假病毒标准物质的释放效果，以期为猪场使用采样专用全棉湿巾对物资、食材、人体等采样提供数据支撑。
1.材料与方法
1.1病毒
基于生物安全考虑，本试验采用非洲猪瘟假病毒标准物质（11000拷贝/ul）代替ASFV活病毒，采购于中国动物疫病预防控制中心。
1.2其他试剂及仪器
采样专用全棉湿巾，购自南京维特康检测技术有限公司；非洲猪瘟荧光定量PCR检测试剂盒，购自青岛立见生物科技有限公司；病毒DNA提取试剂盒，购自上海基灵生物科技有限公司；荧光定量PCR仪（ABI-Stepone），购自ABI公司；各量程移液器，购自Eppendorf；二氧化氯消毒剂，荷兰TwinOxide公司生产；医用纱布、生理盐水均购自药店。
1.3方法
1.3.1采样专用全棉湿巾、医用纱布对高浓度、高剂量的ASFV假病毒的释放效果
(1)先将非洲猪瘟假病毒标准物质进行梯度稀释，使用CT值约21的标准物质。
(2)准备好湿巾和医用纱布，戴手套把湿巾和医用纱布分装到自封袋中，每个自封袋一片纱布和湿巾。所有纱布使用等体积的生理盐水湿润（现场确认医用纱布中加5mL生理盐水）。
(3)使用移液枪将300µL的标准物质分别滴到湿巾和医用纱布上面，做好标记。
(4)样品处理：为避免样品处理人员操作不同造成的试验误差，必须一个人全程处理样品，每个样品揉搓10s。一个样品处理后，接着用移液枪将自封袋中液体吸到1.5mL离心管中。
(5)每组设置3个平行重复，待所有样品收集结束后，提取核酸，分别进行荧光定量PCR反应。
1.3.2采样专用全棉湿巾对低浓度、低剂量的ASFV假病毒的释放效果
(1)先将非洲猪瘟假病毒标准物质进行梯度稀释，使用CT值约26的标准物质。
(2)准备好湿巾，戴手套把湿巾分装到自封袋中，每个自封袋一片湿巾。
(3)使用移液枪将20µL的标准物质滴到湿巾上面，做好标记。
(4)样品处理：为避免样品处理人员操作不同造成的试验误差，必须一个人全程处理样品，每个样品揉搓10s。一个样品处理后，接着用移液枪将自封袋中液体吸到1.5mL离心管中。
(5)每组设置3个平行重复，待所有样品收集结束后，提取核酸，分别进行荧光定量PCR反应。
2.结果
2.1维特康采样专用全棉湿巾、医用纱布对高浓度、高剂量的ASFV假病毒的释放效果
表1湿巾与医用纱布病毒释放能力的荧光定量PCR检测结果
图1荧光定量PCR扩增曲线
图3湿巾与医用纱布病毒释放能力的差异性比较
试验结果表明：从qPCR检测结果来看，原溶液CT值为22.8，医用纱布释放出来ASFV假病毒核酸平均CT值为28.61，相比于对照组，CT值上升5.81。湿巾释放出来的ASFV假病毒核酸平均CT值为28.43，相比于对照组，CT值上升5.63。从统计学角度分析，湿巾与医用纱布释放病毒的效果差异不显著。因此，采样湿巾可以替代医用纱布使用，能够达到相同的采样检测效果。
2.2采样专用全棉湿巾对高浓度、低剂量的ASFV假病毒的释放效果
表2湿巾病毒释放能力的荧光定量PCR检测结果
图2荧光定量PCR扩增曲线
试验结果表明：从qPCR检测结果来看，原溶液CT值为26.71，湿巾释放出来的ASFV假病毒核酸平均CT值为37.13（序号3样品检测异常，不做考虑），相比于对照组，CT值上升10.42。由此证明，采样湿巾能够将低剂量（20µL）的病毒释放出来，检测阳性率66.67%（阳性2/3），说明低剂量的ASFV情况下，采样检测结果存在一定的偶然性或不稳定性，常出现假阴性结果。
讨论
qPCR或普通PCR是目前检测非洲猪瘟病毒的常用检测方法，但无论何种方法，前提均需要采集到合格的样品。目前行业内常用对人员、物资、环境采样的方法是使用生理盐水浸润纱布擦拭表面后装入自封袋中进行实验室检测。然而，医用纱布并非为采样设计的，所以尺寸较大，通常在实验室或现场需要剪裁，然后进行消毒处理。在猪场或实验室制备采样纱布的剪裁过程中，容易人为对纱布造成污染，尤其是正在进行精准剔除的猪场。对ASFV监测与评估的工作可能产生一定程度上的误导。
本试验通过qPCR检测方法，探讨了采样专用全棉湿巾对ASFV病毒的释放作用，试验表明采样专用全棉湿巾对于高剂量与低剂量的ASFV均可以具有良好的释放效果，并且与纱布的释放效果差异不显著。因此，采样专用全棉湿巾可以用作采样使用。
维特康采样专用全棉湿巾独立包装，每个采样包用于一个人、一台设备或一个环境采样点的采样，不会在取采样包时造成交叉污染。纯棉材质吸收力强，符合国际采样器标准用材，提高病原检出率。高压灭菌，无病原残留风险。适用于人体、器械、风机、猪舍环境、车辆等各种区域擦拭取样。
本试验用低剂量的非洲猪瘟假病毒污染湿巾进行检测，结果有一个样品检测阴性，说明当猪场物资、食材、车辆、人员携带相对较低剂量ASFV时，采样检测结果存在一定的偶然性或不稳定性，常出现假阴性结果，也就是说采样结果检测阴性并不能说明物资、食材、车辆、人员不存在传播非洲猪瘟的风险，该结果通常为假阴性。
然而，目前养猪行业大量依靠实验室检测结果来判断生物安全风险及动物感染状态，但物资、食材、车辆、人员等带毒常为微量，评估生物安全风险，不能单纯依靠qPCR检测结果。检测结果阳性，说明带有ASFV核酸，但检测结果阴性，可能是假阴性或存在二氧化氯、次氯酸钠等降解核酸的消毒剂干扰。所以，生物安全必须做过程管控，也就是说：必须管控车辆的洗消过程，检测作为洗消质量的辅助性手段，但不能作为唯一的判断依据。
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