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猪伪狂犬病的监测诊断

来源:李金海 华派生物俱乐部 2021-09-18 09:02:30| 查看:




  伪狂犬病是由伪狂犬病毒(PRV)引起的多种动物共患的以发热,奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要特征的一种重要传染病。猪是伪狂犬病毒的自然宿主,可造成种猪繁殖障碍、仔猪神经症状和早期大量死亡,商品猪呼吸道疾病、生长迟滞,常给猪场造成巨大的经济损失。近年来的流调资料表明,我国猪群gE抗体阳性率仍处于较高水平,野毒依然广泛存在。因此,对该病的防控不能有丝毫松懈。准确地监测诊断是科学防控该病的前提和基础。根据疾病的临诊症状、病理变化,结合流行病学,可做出初步诊断,确诊必须进行实验室检测。
 
1 猪伪狂犬病临床诊断

  猪日龄不同,感染毒株的毒力不同,其临床表现的严重程度也不同。

  1.1种猪主要表现为繁殖障碍

  成年种猪主要表现为繁殖障碍,同时还伴有体温升高(40~41°C),妊娠母猪多见呼吸困难、食欲减退、便秘、水肿和结膜炎等,但很少发生死亡。妊娠母猪流产,产死胎、弱仔、木乃伊胎,其中以产死胎为主。无论是头胎母猪还是经产母猪都会发病,妊娠早﹑中﹑晚期均可发生,而且没有严格的季节性。感染PRV的母猪群,还可长期不发情,屡配不孕,假孕等,有时返情率可达60%以上。种公猪则出现睾丸炎、附睾炎、鞘膜炎等致使睾丸、附睾萎缩硬化,失去种用价值。


伪狂犬造成母猪流产

  1.2产房仔猪大量死亡,有神经症状和拉稀

  以窝为单位,大的症状严重些;鼻塞,打喷嚏;出现口吐白沫和四肢划水、角弓反张的神经症状;部分仔猪出现腹泻;15日龄以内的猪发病死亡率可达100%。


产房仔猪口吐白沫和神经症状

  1.3保育猪顽固性腹泻、神经症状、呕吐

  体温升高,41℃左右,精神沉郁、采食量快速下降,饮水量也显著下降,咳嗽明显,甚至发生“过料”性腹泻;有些表现为神经症状、呕吐;发病率20%~40%,死亡率10%~20%,甚至更高。


保育猪神经症状、腹泻

  1.4中大猪以高热、呼吸道症状为主

  体温升高、咳嗽,临床表现容易与猪蓝耳病和猪流感混淆。变异毒株可导致部分猪出现神经症状;部分猪继发感染传染性胸膜肺炎等病,死亡率可达10~30%,严重时甚至高达50%。


中大猪体温升高、扎堆,后躯瘫痪,继发传染性胸膜肺炎

  临床生产中,很多猪场首先育肥猪或后备猪发病,表现为高热和呼吸道症状,继而病毒传到保育猪,部分猪出现神经症状,如不及时干预,则可造成母猪大批流产、死产,产房小猪出现神经症状和大批死亡。
 
2 病理剖解

  变异毒株毒力明显增加,猪群感染常有典型的猪伪狂犬病变:扁桃体水肿、化脓、出血、溃疡甚至形成伪膜;肝脏、脾脏形成非常典型的黄白色坏死点或白色坏死结节病变;肺脏弥漫性点状出血,肠道出血,肾出血,脑出血、水肿等特别典型的病理变化也可见。

脾脏、肝脏灰白色坏死结节(卢兆彩等)
 
肾脏、肾上腺出血(卢兆彩等)
 
肺脏斑点样出血、黄白色坏死
 
胃粘膜充血、出血、溃疡
 
扁桃体出血、坏死、溃疡
 
脑膜充血、实质出血
 
3 实验室监测、诊断

  猪伪狂犬病原检测可采用动物接种、细胞分离鉴定、分子生物学检测等;抗体检测可采用中和抗体、ELISA、免疫金标等,最常用的是ELISA方法,可检测伪狂犬gE/gI抗体和gB抗体。

  3.1样品采集

  病原学和分子生物学检测可采集病猪脑、肝脏、脾脏、肺脏、淋巴结、肾脏、扁桃体等组织以及鼻咽分泌物。

  血清抗体的检测采集前腔静脉、耳静脉或尾根静脉血。采样前要根据监测的目的,确定采样方案。如果全面掌握猪群伪狂犬感染和免疫抗体水平,采样时建议将猪群按照生产流程分为多个小群体(如将种猪分为种公猪、后备母猪、怀孕中期、怀孕后期、哺乳期母猪群),将仔猪或肉猪群按日龄阶段进行分群(如将猪群分为30天、60天、90天、120天、150天等小群体或按照周龄进行分群),每个阶段(每个小的群体)应采集5-10份样品,种公猪应全部采样监测。

  3.2动物接种试验

  将采集的组织样品匀浆后,加生理盐水制成10%悬浮液,每毫升添加青、链霉素各1000单位,离心取上清液备用。取健康家兔2只,于后腿皮下注射上清液2毫升,家兔于24小时后表现出精神沉郁,发热,呼吸加快,脉搏加快,家兔开始舔接种部位,以后逐渐变成用力撕咬接种点,严重者可出现角弓反张,在地上翻滚,仔细观察患部可发现有出血性皮炎、局部脱毛、皮肤破损出血,家兔表现局部奇痒症状,出现症状4-6小时后病兔衰竭,倒卧于一侧,痉挛,呼吸困难而亡。病料也可接种小鼠,采用脑内或鼻腔接种,有痒的症状,可持续12小时,但小鼠不如家兔敏感。

  3.3细胞分离培养

  病毒的分离是诊断伪狂犬病的最可靠方法。将处理后的病料上清滤过除菌,直接接种敏感细胞,如猪肾传代细胞(PK-15和IBRS-2)、仓鼠肾传代细胞(BHK-21)或鸡胚成纤维细胞(CEF),在接种后24~72 h内可出现典型的细胞病变,若初次接种无细胞病变,可盲传3代。分离到病毒后再用标准阳性血清做中和试验以确诊本病,或结合分子生物学的方法鉴定。

  3.4分子生物学诊断

  可采集组织样品或鼻咽拭子用PCR或荧光PCR方法检测gE基因。需要注意的是伪狂犬病毒核酸DNA的GC含量很高,必须选适合高GC含量扩增的mix或buffer进行扩增。普通PCR方法可参照《GB/T 18641-2018伪狂犬病诊断方法》执行,gD基因检测引物为通用型引物,扩增产物217bp,gE基因检测能区分gE基因缺失株和野毒株,扩增片段为368bp。《GB/T 35911-2018伪狂犬病毒荧光PCR检测方法》推荐了伪狂犬病病毒核酸的多重荧光PCR方法,gH基因探针用FAM标记,野毒和疫苗毒株均能检出,而gE基因探针用HEX标记,只有伪狂犬野毒株能检出。

  3.5血清抗体检测

  ELISA具有特异性强、敏感度高、操作简便、重复性好等特点,也是最简便的方法之一,得到许多国家的认可,已有成熟的商品化伪狂犬gB-ELISA和gE-ELISA抗体检测试剂盒。目前,猪场使用的绝大部分是gE基因缺失疫苗,ELISA检测可以区分免疫抗体和野毒抗体,在猪场净化过程中发挥重要的作用。gB抗体是免疫抗体,需要注意伪狂犬抗体阳性标准和保护标准是有区别的,保护标准通常高于阳性标准,这个要根据试剂商的建议和临床检测大数据确定;gE抗体是野毒感染抗体,仔猪、保育猪和育肥前期的猪gE抗体有可能是母源抗体,伪狂犬gE母源抗体持续时间为90日龄左右,120日龄以后gE抗体阳性代表存在伪狂犬的感染。

 

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