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王长年 赵俊娜:非瘟防控,岂容“烽火戏诸侯”?——浅谈PCR实验室环境污染的监控措施及规范化操作流程

来源:抗非大家谈 2020-01-22 09:41:20| 查看:

 

  编者按:
  
  不以规矩,不能成方圆。实验室环境污染的监控措施及规范化操作流程都是经过长期实践、广泛验证的有效措施,我们只要高度重视、规范化操作就能大幅度降低管理中的风险。毫无疑问,实验室的检测、监测在防控非洲猪瘟方面起到了非常重要的作用!王长年、赵俊娜分享《非瘟防控,岂容“烽火戏诸侯”?——浅谈PCR实验室环境污染的监控措施及规范化操作流程》,推动实验室标准化与规范化运行。
  
  摘要
  
  随着非洲猪瘟(ASF)的来袭,国内荧光定量PCR实验室如雨后春笋般地快速发展。荧光定量PCR方法已成为ASF防控过程中最常见的手段。我们通过调查发现:随着检测量的增加,各实验室的环境污染问题日益突出。2019年初,仇华吉研究员多次在国内ASF防控会议上,从专家的角度呼吁大家在做ASF检测和监测时,务必要防止实验室本身所造成的污染问题。
  
  自此,如何建立实验室,如何防止实验室的污染问题也逐渐引起了大家的关注和重视!我们通过与诸多实验室共同地努力和不断地优化,逐步建立了一套荧光定量PCR实验室的环境污染监控和处理方法,分享给同行,供大家参考。
  
  关键词:PCR实验室 环境污染 监控系统 SOP

 
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  荧光定量PCR技术在国内兽医体系的大量应用,多半是为了防控非洲猪瘟(ASF)。所以很多实验室都是为了应对ASF疫情而仓促上马的,设计不合理、运行不规范,经常会出现实验室污染问题;而这些问题往往未能得到足够的重视,导致出现“阴性对照不成立、甚至出现假阳性”的错误结果。为有效地控制PCR实验室污染,我们通过对实验室的设计和布局、实验室环境污染监控体系的建立以及相关问题的处置、人员的培训等方面来提高PCR实验室检测水平。
  
  01
  
  PART
  
  实验室的设计和布局
  
  1.1 关于PCR实验室的设计和布局
  
  PCR实验室设计的科学与合理是保证实验结果准确的必备条件。我们常见一些实验室由于在设计上的缺陷,导致实验室的环境污染难以去除,甚至不能再进行PCR检测或不愿意使用高敏感的试剂盒来检测(“鸵鸟策略”)!
  
  标准化的 PCR 实验室设计最主要考虑的两个方面:
  
  1、各区独立
  
  2、注意风向
  
  PCR实验室的分区我们按照污染程度来划分:可分为试剂准备区-核酸提取区- PCR扩增区,普通的PCR实验室还有产物分析区,其污染程度依次增大。PCR实验室各个相对独立的区域内要做好正负压的控制,简易的实验室可以安装不同数量的排风扇来实现不同区域的压差。严格分区还要注意实验室内的空气在不同区域的流向问题。我们要防止扩增产物顺空气气流进入上游扩增前的 “洁净” 区域。所以,实验室科学的通风设计在去除气溶胶污染方面是非常有帮助的!
  
  1.2 PCR实验室的设计中常见的一些错误
  
  我们参观和了解过许多实验室,发现有些PCR实验室的设计存在严重的问题。下面是一些常见的设计错误,希望能够引起大家的注意。
  
  1) 中央空调互通:这样就造成实验室各区域的互通,非常容易造成整个实验室的污染,进而不能使用。所以,需要在各区域另行安装分体式空调或者安装PCR实验室专用的分区通风系统。
  
  2) 隔断不密封:有些实验室在分区设计时,只是考虑实验室在形式上的分区(各区分割不完全,有相通之处;各区之间无缓冲间;或者即便有缓冲间,却在装修时采用家庭装修模式-吊轨式推拉门或者平开门,门的下面留有缝隙等等)。
  
  3) 传递窗不密封:如果传递窗不密封,虽然有时方便了试剂、物品在不同实验区间的传递,但同时也增加了交叉污染的风险。一个合格的传递窗应是双开门且密封严实,并且两边的门最好设置连锁装置控制(即一次只能开启一扇门)。此外,传递窗内应配有紫外灯照射装置,并在每次使用后立即进行照射。
  
  02
  
  PART
  
  实验室环境污染的监控体系
  
  建立以及相关问题的处置方法
  
  2.1 PCR实验室环境污染监控的重点
  
  PCR实验室环境污染监控和猪场环境监控的关注点是不一样的。在实验室层面,主要是关注产物和气溶胶的核酸污染问题;而在猪场,则关注对病毒污染的监测。所以,我们对于PCR实验室的监测关注点在重点区域和关键仪器设备方面。
  
  下面是对PCR实验室划分的监测重点区域和关键的仪器耗材:
  
  实验区域:按区域采样:试剂准备区、核酸提取区、 PCR 扩增区。采样重点是在操作台面和控制按钮、冰箱门把手、离心机、枪头盒盖等。
  
  仪器耗材:移液枪、离心机、涡旋振荡器、核酸提取仪、PCR仪等。
  
  2.2 PCR实验室的环境采样
  
  实验室环境采样需要使用专用拭子(一般长度在10-15cm,易折断为佳)。使用时将它浸入装有350-500微升PCR级水的1.5ml离心管中,然后将拭子在离心管壁上适度挤压,去除多余的水。注意:在不同区域采样时需更换拭子。
  
  1)将拭子在长约30cm的取样区域旋转擦拭2-3次(台面或离心机内表面)。然后将拭子放回离心管,涡旋震荡10-15秒,洗脱拭子上捕获的核酸。
  
  2)按上述方法去除拭子上的水,剩下液体作为检测样品。具体采样检测操作如下图所示:

 
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  2.3 PCR实验室气溶胶污染的监控
  
  气溶胶污染的监控主要针对超净工作台和生物安全柜:可以采用空气采样方式。
  
  1) 将6-8层纱布,其面积为30cm*30cm,用PCR级水或无核酸残留的纯净水浸润,打开风机,将其放在出风口5-10分钟后取出。将纱布放在带盖的塑料离心管内,涡旋振荡10-15秒,洗脱纱布上捕获的核酸。
  
  2) 或者,将装有30-50微升PCR级水的1.5ml离心管,敞开盖放置在不同的监测区域12-24小时采样,然后进行检测。
  
  2.4 PCR实验室环境监控频率
  
  我们可以根据实验室不同的等级划分和检测样本的情况,建议采取如下三种频率进行:
  
  1)一般实验室监控频率可以按照: 每周或每两周监测1次进行。【基层实验室】
  
  2)检测样本非常频繁,需要增加监控频率:每周监控1-2次。【集团中心实验室】
  
  3)国家参考实验室:要求每天必须进行实验室环境监控。【专业参考实验室】
  
  2.5 PCR实验室环境监控配套试剂
  
  PCR实验室环境污染的监控需要配备专门的配套检测试剂。IDEXX可以提供各PCR实验室环境监测所需要的相关产品,帮助大家更专业地评估和及时发现实验室可能存在的污染问题。
  
  1)IDEXX RealPCR™ ASFV DNA Mix
  
  2)IDEXX RealPCR™ PC DNA Tracker
  
  (阳性对照追踪DNA检测混合液)
  
  3)IDEXX RealPCR™ Signal Check
  
  (QC细菌DNA检测混合液)
  
  实验室环境监控方案

 
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  * 根据具体实验室检测内容来确定
  
  (ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……)
  
  实验室环境监控结果解读

 
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  * 根据具体实验室检测内容来确定(ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV ……)
  
  2.6 PCR实验室环境污染处理措施
  
  【方法一】将84消毒液配置成最终有效氯浓度为2000 mg/L的溶液,对重点污染区进行擦拭;孵育5分钟后,用洁净的纸巾擦拭干净,再用清水或75%酒精进行两遍清洗。
  
  【方法二】使用商品化核酸清除试剂(如DNAZap、DNAOff或DNAAway)进行处理。使用时直接将商品化试剂喷涂于需要处理的区域,孵育5分钟后用洁净纸巾擦拭干净后,再用清水或75%酒精进行两遍清洗。同时建议配合房间的紫外灯和移动紫外灯(照射高度30-50 cm)对重点污染区、离心机、PCR仪等进行照射。建议消毒完后再进行各房间的通风。
  
  2.7 PCR实验室高风险污染区域的处理方法
  
  移液枪:单按钮移液枪:缓慢匀速移液。各区的移液枪要单独使用且应有各自的标识;使用后,移液枪锥嘴处及表面用75%酒精溶液清洁。若使用过程中发生污染,应及时对移液枪咀使用75%酒精浸泡15分钟左右。可考虑使用Eppendorf R-II移液枪(防止气溶胶污染)。
  
  离心机:每次实验开始前,用75%的酒精擦拭离心机(外表、转子及内壁)。每次实验完毕后,先用84消毒液浸泡过的软布擦洗离心机,再用洁净的湿布擦洗,待干后盖上机盖。每月使用中性去污剂清洁转子与离心室(打开离心机盖,拨掉电源线,用专用设备将离心机转子旋下)。
  
  qPCR仪器:定期清洁热盖和反应槽。具体方法:关机后,将反应槽取出,打开热盖,用95%酒精或异丙醇浸透的棉棒擦拭反应孔(逐孔擦拭,污染严重时需逐孔更换擦拭所用的棉棒)和热盖,待酒精或异丙醇挥发后再将反应槽安装好,将热盖恢复原位。若发生污染严重时则改用中性消毒液,按上述步骤消毒,然后再用95%酒精或异丙醇擦拭。
  
  注意:实验室环境监控出现污染并处理后,仍需要对处理后的效果进行二次评估,确定没有污染后才可以进行实验。
  
  03
  
  PART
  
  PCR实验室人员的培训
  
  PCR实验室人员必需具有专业的素养,必需对实验室检测、监测方面非常清晰和了解,定期进行回顾和培训。建立标准的SOP以及实验室各种规章、制度等。
  
  04
  
  PART
  
  PCR实验室规范化操作流程
  
  (赵俊娜)
  
  建立PCR实验室规范化操作流程(SOP)非常重要!我们只有建立了良好的PCR实验操作规范,才能有效降低实验室环境的污染的发生,使我们的检测结果更为准确!
  
  4.1 实验前:准备工作
  
  1)进不同区域要换不同的拖鞋、穿不同的工作服,戴上手套、口罩等。
  
  2)每日检测前开启紫外灯和移动紫外灯:距离台面30-50cm照射30-60分钟。
  
  3)开启排风柜,保证检测区域空气单向流动。
  
  4)试剂、耗材的准备:特别是在装枪头的时候必需戴一双全新的手套。
  
  5)标记好样本。
  
  4.2 实验中:减少试剂、器具被污染的风险
  
  1)样品的处理:按照规程处理样本;试剂在前,样本在后。
  
  2)最好使用带滤芯的枪头(防止气溶胶的污染)。
  
  3)开管盖时需防止液体接触到手套;操作全程注意防止液体的飞溅和洒出。
  
  4)加样顺序:阴性对照、待检样本、阳性对照(不建议使用高浓度核酸或质粒作为阳性对照)。
  
  5)保存数据,清理废弃物。
  
  4.3 实验后:及时清理,保证环境洁净
  
  1)将吸头、离心管、PCR产物等用消毒液浸泡处理。手套、口罩、鞋套丢弃于指定垃圾桶。若条件允许,则将废弃物与样品一同焚烧处理;或者与第三方合作处理。
  
  2)用84消毒液(按照有效氯2000mg/L浓度,现配现用)擦拭移液枪、仪器(注意PCR仪等属于精密仪器,不建议使用84消毒液)、台面等,作用后再用清水擦拭干净,紫外灯照射。
  
  依次清洁各区的实验台面和地面。各区清洁消毒工具均为专用。注意按照单一方向流程的原则进行清洁。
  
  结论
  
  非瘟防控,实验担当!在非瘟防控过程中,实验室的检测、监测起到了非常重要的作用!我们通过PCR实验室科学的设计和布局、关注通风和风向、定期进行环境污染的监控和处置,能大幅度降低PCR实验室的污染,增加检测结果的准确性,从而为实验室人员树立信心。同时,注意实验室操作人员专业化的培训以及PCR实验室人员规范化的操作,对于获取准确的实验室结果也非常重要!
  
  致谢:
  
  ●仇华吉研究员提供了非常宝贵的建议和意见!
  
  ●IDEXX同事:徐灵龙、李敏华、李昭春、宫大庆、崔保亮提供了非常好的素材和经验分享!

 
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  专家点评
  
  实验室检测结果的准确性事关猪只、猪场、猪场经营者的“生死抉择”,而影响实验结果的准确性中最重要的一环就是如何控制好实验室的环境污染问题。本文作者深入浅出地将PCR实验室的设计、实验室环境污染的监控方法及处理建议以及规范化操作进行了详细地描述和介绍,非常有助于各级PCR实验室的参考和借鉴。
  
  非洲猪瘟俨然上升为事关国计民生的 “大事”!中国非洲猪瘟防控逐步进入深水区-但目前所有的经验、教训、成功案例等都仅代表的是“阶段性的”或“过去式的”成果,离根除非洲猪瘟的目标还有很长的路要走!所以,我们必需时时刻刻都要对非洲猪瘟怀有敬畏之心!我们希望在防控非洲猪瘟的战役中,所有的实验室的非洲猪瘟检测和监测的结果都是准确的!
  
  “幽王烽火戏诸侯”,导致国破家亡的悲剧!非瘟“烽火”已起,ASF检测不可儿戏!我们也期待着业界同仁们从各自专业的角度为赢得这场战役而出谋划策!中国的抗击非瘟的战役将注定会成为中国历史上最伟大的“战役”之一!

 

 

 

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