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非洲猪瘟荧光定量PCR检测常见假阳性结果分析

来源:抗非大家谈——赵和平 2020-11-06 14:51:44| 查看:

  非洲猪瘟疫情发生两年多以来,养殖从业人员对于非洲猪瘟疫情的认识从最初的漠不关心,到谈非色变,如今多数猪场已经找到了防控非洲猪瘟的办法,发现非洲猪瘟可防可控,并不可怕。目前,养猪业通过精准检测发现病原,同时有效执行生物安全措施使得非洲猪瘟防控取得了可喜的进展,可有效遏制疫情发生和蔓延。
  
  非洲猪瘟在我国暴发之初,养殖从业人员对于生物安全管理存在畏难心理,对非洲猪瘟病毒了解不够,普遍认为生物安全太难,无法有效执行。发生非洲猪瘟后,精准清除执行不到位,以至于几乎全军覆没,损失惨重。从今年很多猪场的经验来看,生物安全真正落实到位是可行且行之有效的。另外,选择敏感、稳定、性能优异的检测方法,结合有效的阻断措施后,精准清除的成功率非常高。
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  从笔者走访的猪场所了解的一些案例来看,精准清除失败主要存在两大原因:①生物安全措施执行不到位;②检测系统不科学。
 
  
  非洲猪瘟诊断目前最有效、使用最多的方法是荧光定量PCR检测。荧光定量PCR检测系统由荧光定量PCR仪、荧光定量PCR检测试剂和耗材、核酸提取仪、核酸提取试剂和耗材等组成。设备、试剂和耗材选择和搭配不当,可能导致检测结果不准确。
  
  荧光定量PCR是一种非常敏感的检测方法。实验室经常开展检测工作,一旦实验室管理和环境控制没有执行到位,就存在由于交叉污染出导致假阳性的风险,进而带来临床上误杀猪只的严重后果。下面,分析了一些常见的荧光定量PCR实验室假阳性情况供大家参考。
  
  一、荧光定量PCR检测出现假阳性的常见原因
  
  1. 实验室污染是导致假阳性结果的主要原因
  
  非洲猪瘟野毒感染时血液和组织中病毒载量非常高,经常检测到Ct值15左右的样本。样本处理和提取的过程中需要进行离心操作,这些高浓度的样本离心时容易造成气溶胶污染。对于血液和组织样本,检测非洲猪瘟病毒应该尽可能减少离心操作,这类样本病毒载量高、样本较纯净,可以采用免提取检测。
  
  实验室如果长期检测阳性样本,扩增产物中高浓度的目的片段很容易扩散到空气中并不断累积导致气溶胶污染。
  
  核酸自动提取仪可显著提高实验效率,然而,养殖企业实验室大多使用中小型核酸自动提取仪,并且没有适当的防污染措施,在样本处理过程中可能出现交叉污染。相对于气溶胶污染,样本处理过程中交叉污染导致的假阳性概率较小。
  
  2. 荧光定量PCR试剂盒污染或者非特异性反应
  
  某些试剂盒没有在GMP车间进行生产,或者GMP车间生产过程中车间洁净度不够或人员操作不规范,在试剂盒生产过程中可能出现阳性核酸片段或者质粒污染反应体系的情况。
  
  某些试剂盒生产工艺不过关,可能出现非特异性翘尾现象。
  
  试剂盒中引物、探针等原料品质不过关,质量控制不严格,也可能导致非特异性反应。
  
  3. 荧光定量PCR仪性能不佳导致翘尾
  
  笔者发现某些荧光定量PCR仪性能不佳,在反应后期出现非特异性翘尾峰。
  
  4. 电压不稳导致的基线不稳定
  
  很多养殖企业将实验室设置在猪场附近,使用电源大多是农用电,电压不稳定,会导致扩增基线不稳定。另外,猪场附近的临床实验室停电风险相对较高。建议这些实验室配备UPS紧急电源。
  
  5. 样本或者气泡干扰
  
  反应体系中存在气泡或者某些样本含有特殊成分可能干扰实验,产生非特异性扩增曲线,这种扩增曲线通常不呈现典型的S型扩增曲线形态。
  
  二、如何降低实验室污染和假阳性?
  
  实验室质量管理的关键要素通常离不开人、机、料、法、环,保证实验室质量,减少实验室污染也离不开这几个要素。
  
  1. 加强人员培训,养成良好的实验习惯,建立有效的沟通和激励制度
  
  实验室质量管理最核心的要素是人,必须培养良好的实验操作和卫生习惯;
  
  荧光定量PCR实验室分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区,严格分区管理;
  
  不同区域的移液器用不同的标识区分,防止混用;
  
  不同区域使用不同颜色的实验服区分,防止混穿;
  
  不同区域的耗材、垃圾桶、锐器盒、抹布、拖把不混用;
  
  实验完成后使用84消毒液擦拭地面、台面及移液器等;
  
  实验完成后使用紫外消毒车0.5m左右照射台面30min;
  
  严禁在实验室打开扩增后的荧光定量PCR管,严禁在实验室区域对扩增后的荧光定量PCR产物进行高压灭菌或者加热处理。
  
  2. 选择性能良好的核酸提取仪和荧光定量PCR仪
  
  大型的全自动化核酸提取仪设计时会引入分区设计、紫外防污染、层流防污染等措施,在选购核酸自动提取仪时应该考虑仪器的防污染性能。可以通过阴阳性样本交叉摆放,同时提取最大检测量的样本,来评估核酸提取仪的防污染性能。
  
  关于荧光定量PCR仪的选择,某些仪器热盖设计存在严重缺陷,扩增结束后液体挥发严重,大量扩增产物泄漏,这种荧光定量PCR仪极易导致气溶胶污染。
  
  3.选择带UNG酶防污染体系和内参的荧光定量PCR试剂盒
  
  科学的试剂盒会引入UNG酶防污染体系,同时通过产品设计,保证PCR扩增效率。在降低气溶胶污染同时,保证检测的敏感性。
  
  在荧光定量PCR扩增原料中不加TTP,只加UTP,扩增产物是含有UTP的核酸片段。UNG酶可以水解含有UTP的核酸片段,在扩增程序前添加UNG酶反应程序,可水解反应体系中含UTP的扩增产物,然后使用95℃高温灭活UNG酶,再运行荧光定量PCR反应程序,可以大幅度降低扩增产物气溶胶污染。
  
  某些试剂盒附带的阳性对照浓度非常高(Ct值<25),频繁使用极易造成气溶胶污染。
  
  使用带内参的荧光定量PCR试剂盒监控每个反应是否正常;使用弱阳性的样本(27   
  4. 荧光定量PCR应和普通PCR进行分区管理
  
  某些检测中心针对相同的传染病检测,可能既开展荧光定量PCR检测,又开展普通PCR检测。如果普通PCR的扩增片段覆盖荧光定量PCR反应的扩增片段,则普通PCR的扩增产物极易污染荧光定量PCR检测系统。
  
  5. 规范设计,改善PCR实验室环境
  
  标准PCR实验室通常分为四个区(荧光定量PCR实验室无需产物分析区,分三个区),不同区域执行不同的实验操作(表1),中间品通过双扉传递窗单向传递。不同区域之间空气互相不流通,使用空调净化系统控制不同区域气压,形成压差,控制空气流向。每个区域设置缓冲间,缓冲间外部设置PCR实验室专用走廊(图1)。

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  表1 PCR实验室不同区域划分及功能特点
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  图1 PCR实验室平面布局示意图
  
  注:四个独立工作区,从试剂配制区到产物分析区空气压力逐步降低;试剂配制区和样本处理区是正压室,外开门设计,保证外面的空气不进入;核酸扩增区和产物分析区是负压室,内开门设计,防止里面的空气溢出。
  
  目前很多集团公司中心实验室装修设计越来越规范,但是区域实验室和临床实验室大多条件相对简陋,很难达到标准实验室要求。建议基层实验室在布局时,尽可能分三个房间设置不同功能区,如果做不到空气净化和压差控制,则每个房间应安装排气扇,及时通风。
  
  专家点评
  
  非洲猪瘟背景下,猪场的生物安全风险(包括猪场人员流动、物品流动和猪只流动等)的监测评估、精准清除、引种(包括引入种猪和/或引入公猪精液等)都离不开实验室的检测,尤其是PCR实验室的检测。精准检测也逐渐成为各养猪企业的核心竞争力之一。
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  PCR实验室在检测非洲猪瘟病毒核酸的过程中常见一些假阳性结果, 而这些错误的信息又会给猪场相关管理人员带来极大的心理和工作压力。本文作者就非洲猪瘟PCR检测过程中经常出现的假阳性结果的主因(如样本的采集、运输、保存和处理、阳性对照、试剂盒生产厂家、与之配套的仪器设备等)进行分析,对如何减少和避免假阳性结果发生(如人员培训、仪器配套、内参设置等)以及在实验室建设方面进行科学、合理、规范化的设计(如分区设置、通风处理)等多方面内容进行介绍,非常适合广大基层PCR实验室作为参考。

 

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