核酸提取对非洲猪瘟病毒检测的影响：以鱼粉样本为例

来源：赵和平、廖娟红抗非大家谈 2022-09-03 15:15:00| 查看：次

　　随着非洲猪瘟（简称非瘟）和新冠肺炎疫情的先后暴发，荧光PCR检测技术得到广泛应用，诊断试剂需求呈爆发式增长，性能也有大幅度提升。养殖企业对于荧光定量PCR试剂的性能非常关注，会开展比对实验，测评选择适合自己的试剂盒，但对核酸提取试剂重视不够。很多养殖公司会采购人医领域的核酸提取试剂盒。

　　在新冠肺炎检测中，实验室分工明确，复杂的肺泡冲洗液、污水、粪便、环境擦拭物等样本，通常由疫控中心、海关、传染病医院等特定的检测单位在特定的场景下采集并检测。通常的新冠肺炎筛查样本相对单一且干净。为应对新冠疫情的全民筛查和快速获得结果，人医领域的磁珠自动提取方法从最开始的30～60分钟完成核酸提取缩短到目前的15分钟完成。

　　快速的磁珠提取法对相对“干净”的咽拭子和血液样本，提取核酸的得率和纯度影响可控；而在农牧行业，样本通常比较脏，样本类型复杂多样，对提取试剂盒的性能和适用性要求更高。人医领域的快速磁珠提取试剂盒并不能完全满足兽用检测的需求。

　　饲料原料是引入生物安全风险的一个因素。其中，鱼粉价格昂贵，今年上半年原料价格上涨，养殖企业为控制成本不断压价，在鱼粉中掺杂其他成分的情况比较常见。当鱼粉中添加猪血粉或者肉骨粉时，除了带来饲料转化率的下降，也会带来非洲猪瘟病毒（ASFV）等生物安全风险。今年在多个规模养殖企业采购的饲料原料中（特别是鱼粉）检测到了高浓度的猪源性成分，也有检出ASFV核酸的案例。

　　2022年6月，某养殖公司发现饲料原料出现ASFV核酸污染，通过进一步排查，发现污染来源是鱼粉，该公司采集多份鱼粉样本外送多个实验室进行复测，发现检测结果差异非常明显，Ct值差异大，个别实验室甚至出现阴性结果。通过后续的调查发现，采用不同的提取试剂，是导致检测结果差异的主要因素。
　　

　　01样本

　　选取2批此前发现掺杂了猪血粉导致ASFV核酸污染的问题鱼粉，分别在每份问题鱼粉中选取3个点进行抽样，合计为6份样本，编号标记为1-1、1-2、1-3、2-1、2-2和2-3。

　　02不同核酸提取试剂的评估

　　选择GM柱提取试剂盒、市售的其他4种柱式提取试剂、GM磁珠法提取试剂盒和市售的其他4种磁珠法提取试剂盒，共计10种核酸提取试剂盒对鱼粉样本进行核酸提取并评估。

　　使用同一品牌、同一批次带有猪特异性看家基因为内参照的非瘟荧光定量PCR扩增试剂盒进行扩增。

　　检测荧光PCR仪为上海宏石医疗信息科技有限公司的SLAN48P荧光PCR仪。

　　03不同柱提法提取试剂检测结果存在一定差异

　　6份样本，用不同柱提取试剂盒进行提取，检测获得的非洲猪瘟病毒ASFV核酸检测Ct值（FAM通道，ASFV）和猪看家基因内参Ct值（HEX通道，猪源内参）。

　　用GM柱提取和市售柱提取1、2、3、4共5种柱提取试剂盒，分别提取1号和2号鱼粉核酸，然后检测ASFV核酸，1号鱼粉平均Ct值分别为31.44、32.25、33.74、33.28和31.82，CV值分别为0.90%、2.56%、3.59%、2.11%和2.79%；2号鱼粉平均Ct值分别为31.90、32.19、33.01、32.52和31.86，CV值分别为1.30%、2.05%、3.35%、3.86%和2.26%（表1、图1）。

　　表1不同柱提取试剂检测鱼粉样本中ASFV核酸结果
　　

　　图1不同厂家柱提取试剂检测鱼粉样本中ASFV核酸扩增曲线
　　

　　注：蓝色扩增曲线是ASFV（FAM通道），绿色扩增曲线是猪源性成分（HEX通道）

　　其中CV最小的为GM柱提取，GM柱提取和柱提取4检测Ct值更为靠前（图2）。

　　GM柱提取（Ct平均值31.44）与柱提取2（Ct平均值33.74）检测1号鱼粉Ct值平均值相差2.3，2号鱼粉Ct值平均值相差1.11（GM柱提取Ct平均值31.90，柱提取2的Ct平均值33.01）（表1、图2）。柱提取2 Ct值靠后且CV偏大，选择柱提取2用于鱼粉检测，在病毒载量比较低时有漏检风险。

　　综合判断，GM柱提取敏感性高、稳定性好。
　　

　　图2不同柱式提取Ct值差异示意图

　　04不同磁珠法提取试剂检测结果存在显著差异，2种试剂提取失败

　　6份样本，用不同磁珠法提取试剂盒提取核酸检测ASFV核酸Ct值（FAM通道）和猪看家基因内参（HEX通道）（表2、图3）。No Ct为没有Ct值，低于检测限，结果为阴性。

　　表2不同厂家的磁珠法核酸提取试剂盒检测问题鱼粉中ASFV核酸Ct值
　　

　　图3不同厂家的磁珠法核酸提取试剂检测鱼粉样本中ASFV核酸扩增曲线
　　

　　注：蓝色是ASFV扩增曲线（FAM通道），绿色是猪源性成分扩增曲线（HEX通道）

　　磁珠提取1、GM磁珠提取、磁珠提取2、磁珠提取3、磁珠提取4五种磁珠提取试剂盒检测1号鱼粉ASFV核酸Ct值平均值为33.18、32.67、阴性、阴性和34.52，CV值分别为3.78%、0.62%、阴性、阴性、6.53%，检测2号鱼粉ASFV核酸Ct值平均值为33.28、33.43、40.25、阴性、33.59，CV值分别为3.68%、1.15%、10.47%、阴性、3.69%（表3）。

　　其中CV最小的为GM磁珠提取，GM磁珠提取和磁珠提取1检测Ct值更为靠前，磁珠提取2和磁珠提取3导致了漏检。

　　综合判断，GM磁珠提取针对鱼粉样本效率高且性能稳定。

　　表3不同磁珠提取试剂检测鱼粉样本中ASFV核酸结果
　　

　　磁珠提取1、GM柱提取、磁珠提取2、磁珠提取3、磁珠提取4，5种磁珠提取试剂盒检测1号鱼粉猪源性成分Ct值平均值为26.47、26.71、32.04、阴性、28.10，CV值分别为1.31%、2.06%、5.09%、阴性、1.35%，检测2号鱼粉猪源性成分Ct值平均值为26.74、26.75、32.00、NoCt、28.43，CV值分别为2.65%、1.80%、5.25%、阴性、0.75%（见表4）。

　　其中磁珠提取1、GM磁珠提取检测Ct值更为靠前且CV值都小于3%，磁珠提取3无法提取出核酸，磁珠提取2和磁珠提取4 Ct值明显偏大，提取效率低。

　　表4不同磁珠提取试剂检测鱼粉样本中猪源性成分核酸结果
　　

　　05提取核酸纯度和浓度共同影响着实验结果，提取浓度高、纯度好，检测敏感性更高

　　对问题鱼粉样本，用不同核酸提取试剂盒提取核酸后，检测结果存在明显差异，为了分析原因，进一步用超微量分光光度计检测获得的核酸的浓度和纯度，结果发现，提取核酸纯度和浓度共同影响着检测结果（表5和表6）。

　　GM柱提取和柱提取2检测结果差异显著，检测发现GM柱提取获得的核酸浓度更高，A260/A 280比值更大，纯度更高。柱提取4综合性能优于柱提取2，两种试剂提取核酸的差异主要体现在核酸得率上。

　　表5不同柱式提取试剂盒的核酸浓度和纯度
　　

　　注：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A 280比值为2.0，A260/A 280比值越高核酸纯度越高。核酸浓度越高，说明试剂盒的得率越高。

　　GM磁珠提取和磁珠提取1检测结果差异不显著，磁珠提取1提取的核酸浓度比GM磁珠提取高，但核酸纯度低于GM磁珠提取。

　　GM磁珠提取和磁珠提取3检测结果差异显著。磁珠提取3提取的核酸纯度与GM磁珠提取相比，差异不显著（表7），但是该试剂提取的核酸浓度非常低（表6），检测失败。

　　GM磁珠提取和磁珠提取2检测结果差异显著。磁珠提取2提取核酸浓度较高（表6），但是该试剂提取的核酸纯度差（表7），检测失败。

　　表6不同磁珠提取试剂盒的核酸浓度（μg/mL）
　　

　　表7不同磁珠提取试剂盒的核酸纯度（A260/A 280比值）
　　

　　注：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA的A260/A 280比值为2.0。核酸浓度越高，说明试剂盒的得率越高。

　　06 分析与提示

　　在提取鱼粉样本中的核酸过程中，不同的提取试剂盒提取效果差异明显，直接影响下游的PCR试剂盒的扩增，导致最终的结果完全不同。其中柱提取方法差异相对较小，磁珠法提取核酸检测结果差异非常大。

　　鱼粉中蛋白含量高，难以提取，掺杂了猪血粉等成分后，更容易对检测带来干扰。在鱼粉等高蛋白样本提取过程中，柱提取具有相对优势。分析数据显示，柱提取法与磁珠法提取相比，获得的核酸浓度较低，但核酸纯度普遍更高。

　　本次实验分别用5种柱提取试剂盒和5种磁珠提取试剂提取鱼粉中的核酸进行评估，当提取的核酸（A260/A280低于1.3时，核酸纯度过低，会影响PCR的扩增效率；当核酸浓度低于5μg/mL时，检测结果呈假阴性，即使是含量高的猪源性成分也检测失败。实验中用到的问题鱼粉，送到三方检测实验室专门检测猪源性成分，也显示不同的实验室结果差异明显。

　　在养殖公司常规的核酸提取试剂盒评估过程中，往往会忽略核酸提取试剂盒对不同样本的兼容性。对脏样本和复杂样本的提取效果及提取到的核酸的纯度与浓度的评估比较少。实验室在选择提取试剂盒时有必要开展这一评估。

　　2022年4月，某集团公司发现鱼粉中存在ASFV核酸的污染，荧光PCR检测Ct值28左右，当初笔者以为是个例，后续在另外一个省的另外一家集团公司再次检到阳性，鱼粉掺杂其他成分，导致ASFV核酸污染并不少见。很多时候是因为选择提取试剂选择不当，未检测到，或者检测Ct值明显滞后未发现异常。

　　我们的实验数据表明，被污染的鱼粉检测失败主要与提取试剂选择不当有关。人医领域的提取追求极致的简单和快捷，对于纯净的样本不会有太大的影响，但是适合的样本类型有限，很多复杂的样本（饲料原料、精液、混杂了泥土或消毒剂的擦拭物）提取效率大幅度降低，容易导致检测结果失败。

　　鱼粉作为重要的高价值蛋白原料，一些不法之徒为了降低成本在其中掺杂猪血粉、肉骨粉，甚至鸡肉粉、羽毛粉等。基于此，饲料和养殖企业有必要对鱼粉原料开展质检，用特异性的qPCR检测试剂盒检测其中猪源性或鸡源性成分，并进行定量，以评估其质量。

　　在核酸提取过程中，除了考虑提取到的核酸的纯度和浓度，还需要注意核酸pH值的变化，笔者曾经见过环境样本提取的核酸，pH值高达9～10，超出PCR反应体系的缓冲能力，直接导致实验结果呈假阴性。

　　除了筛选合适的提取试剂盒，要保证检测结果准确性，还要选择带内参的qPCR试剂，监控每一个样本是否正常，减少假阴性结果。

　　随着非瘟疫情的演化，弱毒株占比越来越高。弱毒株病毒载量低，很多人、车和环境擦拭物样本Ct值介于35～40之间，极易出现漏检，引发感染风险。实验室需要评估分子诊断系统的敏感性，保证整体性能最优。核酸提取环节尤其值得关注，选择样本适用性广、兼容性更高、提取核酸纯度高的提取试剂盒，能更好地保证荧光定量PCR检测结果的准确性，在非瘟防控中，能更早发现风险，及时处理。

　　魔鬼藏于细节，做好疫病检测和生物安全防控都需要抓细节，强执行。同时，企业要在未来日趋激烈的竞争中生存下来，发展壮大，又要保证大方向正确。这就要求企业注重组织能力和人才梯队建设，请专业的人做专业的事情，配备好检测技术人员，充分用好外部资源对人员进行培训，不断提升技术能力。

　　专家点评
　　

　　成本控制是养殖企业生存之基，而非瘟防控精准、科学，才能更好的节省成本。核酸检测系统由荧光定量PCR仪、荧光定量PCR试剂、核酸提取仪、核酸提取试剂、质控品等组成，在非瘟病毒核酸检测过程中要获得准确的检测结果，需要整个检测系统的配合。目前非洲猪瘟检测实验室对于荧光PCR试剂盒质量关注较多，而对荧光PCR仪、核酸提取仪、提取试剂的质量关注不够。文章在核酸提取的关键环节，对不同提取试剂盒进行比对，发现不适合的提取试剂，会大大影响非瘟病毒核酸的检测效果。这篇文章给养殖企业非常重要的提醒，在非洲检测过程中，不仅要关注荧光PCR试剂盒的质量，更应关注提取试剂盒的质量。养殖投入品采购过程中不能盲目追求低价，有必要把好检测关口，防止病原通过原料和物资传入。

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