哈兽研：我国出现基因I型非洲猪瘟病毒，及其毒力研究和来源分析，各类疫苗研究进展
来源：哈兽研 2021-11-01 15:44:07| 查看：
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非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病。非洲猪瘟的发病率和死亡率可达100%，严重危害着全球养猪业，造成难以估量的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
哈兽研最新一份研究文章显示，他们的一个研究团队在山东和河南地区分别分离到了基因I型的非洲猪瘟病毒，两个毒株均为低毒力毒株。随后他们对分离到的病毒的致病性和传播性进行了实验室研究，并分析了病毒可能的来源。
两例基因I型的确诊
2021年6月，山东某猪场一头重约80公斤的育肥猪出现麻痹症状，被安乐死后进行剖检。收集了肺部样本并运送到中国国家非洲猪瘟辅助参考实验室（CNASFPL）进行非瘟检测。在河南省的另一个猪场，育肥猪出现了慢性感染症状，包括体重减轻、间歇性发热、皮肤溃疡和关节炎；还观察到零星死亡。收集了四头死猪的样本，包括淋巴结和脾脏，并将其运送到CNASFPL进行ASFV检测。所有样本均通过针对病毒p72基因的qPCR确认为非洲猪瘟阳性。对p72基因的进一步序列分析表明，这些样本中的非瘟病毒属于基因型I。
基因I型感染的症状
为了确定所分离到的基因I型毒株的致病性，研究者把山东株在活猪上进行了测试。每组6头SPF猪分别肌注10^3 TCID50和10^6 TCID50剂量的病毒。在接种后的第3-18天，所有被攻毒的猪都不同程度表现出间歇性发热。在10^6剂量的攻毒组中，三头猪在第11天开始在颈部、耳后、腹部甚至全身的皮肤上出现丘疹。从第13天和第17天开始，所有六头猪都开始出现关节病；两只猪分别在接种后第14天和第25天开始跛行。两只猪分别在注射后第17天和第20天出现多发局灶性皮肤坏死。在28天的观察期内，所有的猪都存活了下来。
基因I型的排毒情况
为了评估病毒脱落和病毒血症的情况，对实验猪进行了口腔拭子、直肠拭子和血液样本的采集，每隔一天使用qPCR检测ASFV基因组DNA。对于接种了10^6 TCID50山东株的猪，在第5天的口腔拭子、第7天的直肠拭子和第7天的血液中可检测到病毒DNA。对于接种了10^3 TCID50病毒的猪，在接种后第9天的口腔拭子、接种后第11天的直肠拭子和接种后第7天的血液中可检测到病毒DNA。在所有接种猪感染后超过28天，在口腔和直肠拭子中检测到病毒DNA。一般来说，与直肠拭子相比，口腔拭子中的病毒脱落更早且水平更高。
各型非洲猪瘟疫苗研究进展
近年来，非瘟疫苗在全球范围内获得显著突破，我们今天就来讲一讲疫苗到底研究到了哪一步。
灭活苗
在非洲猪瘟疫苗的研究历史中，灭活苗是最早被开发出来的，不同实验证实灭活苗的保护率只有0%-70%。
可分为病毒灭活和病毒致弱灭活；
不能对强毒攻击提供有效的免疫保护；
可产生高效价的抗体，很难检测到中和抗体；
新型佐剂Polygen或Emulsigen-D的应用：可产生ASFV特异性抗体，但未能提高疫苗的免疫保护效力；
细胞免疫在ASF灭活疫苗免疫保护中起重要作用；
低代次和高代次的ASFV毒株对中和抗体的敏感性存在差异。
减毒活疫苗
可以诱导强烈持久的免疫应答，与其他类型疫苗相比，弱毒苗的保护性更高，但生物安全是其使用的主要限制因素。
目前可通过基因重组、靶向缺失以及一次性侵染技术来增强减毒活疫苗的安全性。
弱毒苗主要分为自然弱毒苗、传代弱毒苗和重组弱毒苗。
自然弱毒苗
自然弱毒苗是从自然界中分离到的非洲猪瘟弱毒株，如天然致弱毒株OURT88/3或NH/P68；
自然弱毒苗可以产生对同源强毒株的攻毒保护，依据实验动物和攻毒毒株的不同，保护率介于66%-100%；
OURT88/3毒株产生的免疫保护与病毒特异性IFN-γ产生细胞呈正相关；
交叉保护疫苗:OURT88/3免疫并用致病性OURT88/1毒株进行加强免疫，产生针对ASFV-I型不同分离毒株的保护；
这类疫苗在强毒攻毒的实验中得到的保护率很高，很多可以达到100%，但是副作用和安全性问题突出。副反应:发热、关节肿胀、肺炎、流产、死亡等，慢性感染；
其中研究比较多，比较有前景的是Lv17/WB/Rie1毒株。
传代弱毒苗
强毒株经过猪骨髓来源细胞、Vero和COS-1等敏感细胞系进行的传代致弱。
ASFV致病力逐渐下降，但病毒免疫原性和稳定性也随之下降；
1960年代，西班牙和葡萄牙使用传代致弱毒株免疫动物用于非瘟净化，但是产生了灾难性的后果，呈现出肺炎、流产和死亡等副作用；
田间多次感染和异源强毒株存在的条件下，免疫动物呈现ASF慢性感染。
重组弱毒苗
一般通过敲除病毒功能基因、毒力基因、免疫抑制基因来设计疫苗；
降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答；
比传统弱毒疫苗安全性更好,效力更高的基因工程减毒活疫苗；
目前研究设计的毒力基因包括TK(K196R)、9GL(B119L)、CD2v(EP402R)、DP148R、NL(DP71L)、UK(DP96R)和多基因家族360，505(MGF360/505)
缺失毒株接种宿主毒力减弱,产生针对同源毒株或异源毒株的免疫保护
活载体疫苗
通常使用腺病毒或痘病毒作为载体：可引起细胞免疫和CTL反应；
“鸡尾酒”式免疫：
人腺病毒Ad5载体+ASFV-p32、p54、p72和pp62；或ASFV-A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L和K205R-A104R；
可引起良好的抗原特异性CTL反应，以及强烈的体液免疫反应和细胞免疫应答。
核酸疫苗
将编码病毒主要抗原的基因克隆入真核表达载体后直接导入机体内，在宿主细胞内完成转录翻译后产生抗原蛋白，从而同时激活体液免疫和细胞免疫应答。
ASFV DNA疫苗(p72、p30和p54)：不能够提供攻毒保护；
ASFV DNA疫苗(p30、p54、猪白细胞抗原II)：无ASFV抗体，部分动物获得攻毒保护；
ASFV DNA疫苗(表达文库)：60%的保护力，有待于发掘更多保护性抗原；
亚单位疫苗
杆状病毒表达系统：p72、p30和p54等，不能提供有效的免疫攻毒保护，说明仅仅依靠上述抗原刺激产生的中和抗体很难获得理想的免疫保护效果。
人源293(HEK)细胞表达系统：B646L(p72)、E183L(p54)和O61R(p12)，与痘病毒载体疫苗进行首免-加强免疫，获得较好的体液免疫和细胞免疫水平。
展望
对于减毒活疫苗来说，无论是采用经典方法还是通过基因操作，它们都能提供较好的保护水平，（至少对同源毒株是如此）。这一战略被认为更接近市场，几乎所有的研究小组都寄希望于此。
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