摘要：2019年5月23日，云南省文山壮族苗族自治州砚山县维摩乡散养户饲养的猪发生疑似非洲猪瘟疫情。文山州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室运用PCR核酸检测技术结合临床剖检，对该起疫情进行了初步诊断，并经云南省动物疫病预防控制中心兽医实验室复核，确诊为非洲猪瘟病毒感染。此次非洲猪瘟的临床诊断与PCR检测，为基层实验室非洲猪瘟诊断积累了经验，对非洲猪瘟的早发现、早控制具有积极意义。

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、烈性、高度接触性动物传染病。ASF最早于1921年在肯尼亚首次报道，并从非洲相继扩散到欧洲、美洲和亚洲，2018年首次传入我国，是世界动物卫生组织（OIE）规定的须通报动物疫病，是我国的一类动物疫病。ASF发病率和病死率可高达100%，且因无有效疫苗和药物治疗，其扩散和流行对养猪产业造成了毁灭性打击，严重困扰养猪业的生产与发展，影响着猪肉产品的安全与供给。

基层兽医实验室是动物疫病防控的技术保障与根基。目前，基层兽医诊断技术主要有临床诊断与实验室检测。基层兽医的临床诊断技术对非洲猪瘟的早期监测与排查具有重要意义。基层兽医分子生物学实验室的有效运转及PCR检测技术的充分运用，为基层有效预防、控制和扑灭ASF疫情，维护养猪业健康稳定发展奠定了坚实基础。2017年9月，文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室建成并投入使用，并首先将分子生物学PCR检测技术应用于禽流感的监测预警。当前可靠性最佳的ASF诊断技术是基于核酸检测的PCR和定量PCR技术。2019年5月23日，云南省文山壮族苗族自治州砚山县维摩乡散养户饲养的猪发生疑似ASF疫情。文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室运用PCR核酸检测技术结合临床剖检，对该起疫情进行了初步诊断。这是对中心兽医分子生物学实验室管理体系、PCR检测综合能力的一次考验与检验。总结此次文山州首例ASF病例的紧急检测工作经验，可为发挥基层兽医实验室在防控ASF等重大动物疫病中的作用提供帮助。

　　临床观察与剖检

赴现场向养殖户询问疫情发生情况、病猪临床表现。对一饲养户养殖的2头白毛家猪，另一户养殖的2头黑毛家猪，共4头病死猪进行剖检。

　　PCR检测

　　样品处理。病原样品：2头病死猪均为肥猪（黑、白家猪各1头）。分别采集2头病猪的脾脏、淋巴结、肾脏、肺脏共8个样品送检。病原组织样品研磨处理：将病原样品编号，使用高压灭菌的剪刀和研钵，分别取适当组织样品剪碎于研钵中，研磨至匀浆状态，对应编号，保存于2mL灭菌离心管中备用。

　　样品DNA提取。将离心管中的组织匀浆样品，对称放置于冷冻离心机，4℃ 12000r/min离心5min；每个样品取200μL上清液至磁珠法病毒DNA提取试剂盒中，按试剂盒要求加入25μL酶，最后放入全自动核酸提取仪中，设置DNA提取程序，启动全自动核酸提取仪，提取病原样品DNA；程序运行结束后，将提取的核酸保存于-80℃备用。

　　PCR体系配置。在灭菌的1.5mL离心管中，制备符合试验样本量（包括阳性、阴性对照等）的PCR反应混合物（23μL）。配置步骤：将23μL PCR反应混和液加入到0.2L PCR管中，再将2μL DNA模板加入到PCR管中，另设立阳性、阴性对照；每管加入2μL模板后，密封反应管，瞬时离心；将所有PCR管放在PCR仪中进行扩增。

　　凝胶电泳及成像。分别取7μL混匀的PCR产物加入到1×TAE缓冲液配制的2%琼脂糖凝胶中电泳30~40min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。

　　临床症状与剖检

经向养殖户询问得知，猪病死前2~3d，有厌食、喜卧、疲惫以及偶有呕吐等症状。对4头病死猪临床观察发现，病死猪体表均出现紫色瘀斑（图1）。剖检发现，脾脏异常肿大（大5~10倍），颜色发黑，质脆易碎（图2）；肺脏肿大，肾脏肿胀明显、色淡，有少量出血点（图3）；胸腔、心包腔内有积液。

　　PCR电泳

PCR扩增结果显示，8个样本中有7个样品在257 bp左右有特异性扩增条带，与阳性对照一致（图4），4号（肺脏）样品无特异性扩增条带。

病死猪体表出现紫色瘀斑，脾脏异常肿大等均符合典型ASF症状；8个样本中，有7个PCR检测出现ASFV的特异性扩增条带。由此，判断该病死猪疑似感染ASFV。随后按有关要求送样至云南省级动物疫病预防控制中心经实验室复核。截至2019年5月25日疫情发布，相关养殖户存栏生猪104头，发病49头，死亡48头。疫情发生后，当地已按照要求启动应急响应机制，采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等应急处置措施，对全部病死猪和扑杀猪进行无害化处理。同时，禁止所有生猪及其产品出入封锁区。

本次疫情是文山壮族苗族自治州首例ASF疫情。这次疫情考验了文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制系统的“防控作战”能力与建设情况，也检验了文山少数民族自治区基层兽医人员的专业技能与基本功。目前，文山壮族苗族自治州动物疫病预防控制中心兽医分子生物学实验室配备普通PCR检测设备，PCR试剂、引物均与云南省动物疫病预防控制中心要求一致，且检测技术人员均经过省动物疫病预防控制中心的专业指导与培训，实验室已通过全省ASF检测能力比对。本次样品的ASFV检测，从样品的接收、处理、核酸提取至PCR扩增及电泳结果上报，均有条不絮地按实验室内部操作程序与质量管理体系进行，是中心兽医分子生物学实验室建成以来一次紧急检测的成功案例。

快速可靠的检测方法对于及时诊断和预防ASF至关重要。基层兽医人员将临床诊断技术与可靠的分子生物PCR检测技术相结合，提高了基层兽医对ASF等动物疫病早期诊断、预防与控制的科学性。诊断方法中的实验室检测是确诊ASF的重要依据。基层兽医实验室开展ASF PCR初步检测，对于加强ASF监测预警，及时发现ASFV感染和疑似感染疫情具有重要意义。此次ASF PCR检测诊断为砚山县动物疫控中心做好ASF疫情处置准备工作奠定了基础，为及时开展ASF防控工作争取了宝贵时间。PCR检测技术在基层兽医实验室的运用增强了ASF等动物疫病防控工作的主动性和目的性，为科学评估疫情风险提供了技术支持。总结本次ASF PCR检测工作发现，兽医分子生物学实验室的常规PCR检测存在耗时长、试验过程产生的污染物易导致实验室核酸污染及实验室生物安全等问题。建议基层实验室购置快速、准确的荧光定量PCR仪，以缩短检测时间，减少污染，提高检测结果的准确性。今后，应逐步提高基层兽医实验室检测技术，继续充实ASF等重大动物疫病检测、监测的资金投入，完善中心兽医实验室的硬件设施，重视“软件”建设及管理，加强兽医分子生物学实验室生物安全防控，充分发挥基层兽医分子生物学实验室在动物疫病防控中的作用。

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（责任编辑：朱迪国）