1、对于临床血清学检测，对于没有标准血清的情况下，如何建立标准血清库？（丁家波，中国兽医药品监察所）
答：当我们检测抗体的时候，我们要知道它的抗体包括哪几种类型，它的消长规律，我们需要模拟它。血清学检测标准的建立需要建立在足够量的样品的基础上。对于问题中提到的如何建立标准血清库，实际上是参考血清库的建立。因为标准血清我们是要给它赋值的，我们需要根据它来定相应的值。而参考血清对我们很重要，因为实际上试剂盒里面，我们对于特异性和敏感性是怎么来进行的，敏感性是对阳性样本的吻合性，特异性是对阴性样本的吻合性，所以这个时候我们要有大量的阳性样本和阴性样本，你的问题在进一步来说其实是问如何来确认具有代表性的阳性样本还是阴性样本。不同的病是不一样的，像我们布鲁氏菌病，需要多种不同的方法去筛选，去认证它，我们需要了解这个病发生的背景，布病的检测从1897年就开始了，而后诊断方法得到不断的改进，现如今补体结合实验问世已经106年，它有很高的准确性和特异性，然后在这个基础上，布病才出现了标准品。这个标准品之所以能建立，是在于我们几乎找尽了所有能够使用的所有方法来验证以保证我们所选血清的代表性和真实性，不同的病只有经历长时间的追踪和研究，才能够得出某种血清的符合性，然后才能被纳入所谓的参考血清或标准血清。
2、对于指导生猪生产我们应该如何选择不同的非洲猪瘟检测方法，比如抗原检测还是抗体检测？（路易斯·吉梅内斯-里罗拉，爱荷华州立大学）
答：选择抗原还是抗体主要取决于两个方面，第一个我们检测的目的是什么？第二个疾病的发病状态处于哪个阶段？比如说，刚开始疫病暴发的时候，我们会选择PCR进行抗原检测，因为我们需要快速的鉴别诊断出哪些是感染动物便于剔除；第二个随着疾病的发展，比如在非洲有多个毒株，或者欧洲的毒株还没有被完全清除掉，有可能这个毒株会致弱，会出现无症状的携带者，包括还有一些新的毒株的引进，这个时候我们的诊断目的就变成了，要了解非洲猪瘟在整个群体里的流行率，这个时候抗体的检测就变得更重要了。
3、禽弧肠病毒的基因分型情况，以及目前流行的基因型是什么？（侯丽·塞勒，佐治亚大学）
答：很遗憾，现在没有一个全球的广泛分布的单个基因型存在；在已经发现的7个基因型中，在2012-2014年，基因5型占有优势，近两年，基因4型和基因2型有增加趋势，其中基因4型跟临床病例是比较密切的，基因型与临床没有明显的对应关系，即不是说检出某一个基因型就一定表现某种临床症状。
4、非洲猪瘟造成的流产，流产胎儿是否有典型的病理组织学病变？（理查德·弗兰奇，国际动物卫生合作伙伴）
答：目前非洲猪瘟主要是急性和超急性的案例，可以引起母猪一些急性的临床病变。如果我们可以在胎儿的血液或者体液中检测到病毒的DNA，但是在胎儿中通常还不会看到病变，所以当我们看到流产的胎儿我们首先要考虑的应该是其他疾病而不是非洲猪瘟所导致的流产。
5、非洲猪瘟病毒在MA-104细胞中连续传代过程中病毒会不会致弱？如果存在致弱的情况，大约最多可以扩增多少代？（道格·格拉杜，美国农业部梅花岛实验室）
答：答案是否定的，这个细胞系仅仅在诊断病毒上有它的价值。
6、MA-104细胞作为一种候选细胞系，会不会随着细胞传代增加导致病毒不能够很好的增殖？（道格·格拉杜，美国农业部梅花岛实验室）
答：它能支持病毒的生长，随着传代会发生丢失这个缺陷，所以不能用于传代致弱或者疫苗研发。如果作为检测目的使用，MA-104细胞系与IPAM细胞系的表现是差不多的，仅仅是滴度低一些。
7、请问PEDV分离培养主要选择什么细胞呢？减毒培养需要注意什么？怎么保证PEDV可以一直传代培养而且在临床毒力不返强？（王秋红，俄亥俄州立大学）
答：从全球发表的文章来看，主要还是选择Vero细胞，但是Vero细胞有不同的种类，所以我个人建议可以对不同来源的Vero细胞进行尝试，从而选择滴度最高的那一类别使用。持续传代时要用尽可能低的MOI进行传代，而且每过10代或者20代，最好要对病毒进行测序，来看看病毒有什么变化。
8、是否能将弱毒苗用在断奶仔猪或者较大日龄的仔猪上进行紧急发病后猪的控制，对弱毒苗的接种方式和剂量是否有一定的建议（王秋红，俄亥俄州立大学）
答：对于自然感染而存活下来的仔猪，其本身已经对该病具有了很好的免疫力。
9、目前高通量在兽医领域应用越来越多，但是存在速度慢，成本高的问题，除了新病原的挖掘，请问该技术如何更好为猪场临床提供服务？（王乐义，伊利诺伊大学）
答：目前对于高通量测序，对于DNA测序，在各项文库顺利建好的前提下已经可以做到在24小时内获得初步结果，而对于RNA测序，由于随机扩增等程序可能速度会稍慢一些。
10、在您实验室的大量检测中，您样品分子检测会做重复吗？对于临界值样品的判定是如何把握，如果复检是重新提取核酸还是用前一次提取的核酸样品？如何增强对可疑样本的判定准确性，进行三次检测够吗？（张建强，爱荷华州立大学）
答：对于重复检测要依据样品的不同类别分以下几种情况。如果是复检血清、口腔液等样品，需要做重复核酸提取。如果是复检肺组织等样品，可以选择重新处理样品、或者选择使用前面保留的处理好的组织液继续提取核酸、亦或直接使用前面提取好的核酸样品检测即可。
11、猪的轮状病毒非常多样，目前生猪产业中腹泻病中PED的影响非常大，猪轮状病毒检出率相对较少，请问其临床重要性如何？除此外当前对生猪产业影响最大的是哪一组的轮状病毒，该如何进行检测？（白建法，堪萨斯州立大学）
答：轮状病毒大家都知道，可以造成腹泻。传统上讲，A组的轮状病毒占主导地位，在80年代末90年代初，B组和C组的影响逐渐变大。近年来C组和A组趋势加强，在一些腹泻的病料中经常可以检测到。对于C组可能由于目前还没有很多的序列作为探针进行检测，所以检出率较少。
12、养猪场如何能建立符合标准的检测实验室，需要注意哪些事项。（王君玮，中国动物卫生与流行病学中心）
答：对于猪场实验室的建设，首先需要依据猪场的规模及疫病健康管理需要来设计实验室需要开展哪些的工作；其次，猪场实验室如果涉及到病原学检测还要考虑实验室的级别，最低要达到P2级别，而在实验室级别建设方面，要对应着相应的实验室级别配备相应的设备和硬件建设。实验室建设方面还会涉及到认证工作。我们国家目前对于二级实验室还没有强制性的认证，但是下一步，有很多的工作会要求达到一定的水平后才会准入。
13、田老师，您好，非瘟检测诊断将从分子诊断过渡到分子检测和抗体检测并行的情况，请问临床中如何结合使用好两种检测方法，特别是抗体试剂盒如何选择，是使用阻断法还是竞争法更好。（田克恭，国家兽用药品工程技术研究中心）
答：非洲猪瘟从2018年8月以来，经历一个由暴发流行阶段到目前的常态化流行阶段。在一开始，暴发阶段仅仅只是野毒流行感染，这个时候通常采用核酸检测就足够了，现在对于猪群除了野毒，还需要关注缺失疫苗毒株，而这种现状无疑增加了非瘟拔牙及防控的难度。在这个过程中，核酸诊断还是需要的，在这一基础上，我们还需要区分不同类型毒株，任何一个传染病，包括新冠，在它流行暴发初期，通过分子诊断通过核酸检测，即病原检测就可以，但是流行到一定阶段都是需要进行抗体检测。随着弱毒疫苗在临床上被运用后，非洲猪瘟通检抗体的方法就需要被建立和运用，我们需要针对于MGF、CD2V等的抗体检测方法，针对MGF的抗体检测目前我和我的实验室还没有建立出很好的方法，而针对CD2V，我们目前已经通过不同的截短表达的策略，通过不同的表达系统和不同的标签加入和不同的纯化策略，拿到了一个比较好的抗体检测方法。除此外，临床上近来又面临着新的问题，及即一些不同成分的亚单位疫苗被临床应用，这个时候就需要建立一些不同于一些常规组分（例如：P30、P54、P72、CD2V、MGF等）的抗体检测方法，否则将难以区分野毒还是疫苗毒。我手上有92个针对非洲猪瘟不同的蛋白，其中有10多个已经在有资质的实验内评价过。至于用间接法还是竞争法哪种方法更好，我觉得竞争法有竞争法的好处，间接法如果做到极致，也是可以的。如果间接法做不到极致，那么做竞争法就需要做到极致，这个方法上都各有所长，但是都需要尽最大努力做到极致，而非洲猪瘟的检测方法有没有做到极致，在临床上是最能够得到直接的验证。
14、分子检测：对于目前新的基于CRISPR-Cas核酸检测技术未来发展怎么样？等温扩增时间快，灵敏度高，为什么这么多年一直没有发展起来？ （原霖，中国动物疫病预防控制中心）
答：对于CRISPR-Cas技术在诊断方面的进展我们一直在关注。今年由于新冠的促进，人医方面已经有相关的诊断产品问世，但是在兽医方面还没有相关的产品。对于这种新技术在诊断方面的发展，我们还要从以下两个方面去关注，首先我们要看是否有公司去推出相关的产品，我们需要通过一些评价指标：敏感性、特异性、临床敏感性、临床特异性、重复性等等，来综合判断这个技术性产品的性能究竟如何，其次还要考虑成本的问题。对于第二个有关等温扩增技术为什么这么多年没发展起来的问题，我认为这项技术由于非洲猪瘟的发生和促进，已经取得了很大的进展，在非洲猪瘟没出现之前才算没有发展。当然每种方法都有它的有点和缺点，问题中所谈到的没有发展起来应该指的是与荧光定量的方法去比，因为对于荧光定量的方法在成本控制和技术成熟度上，目前还没有哪种方法可以与之媲美或者超越它。而对于等温扩增（LAMP），也有它的优势存在，例如它的设备简单、检测时长短，现在很多方面也得到了应用，但是与荧光定量相比在成本和敏感性方面还是存在差异。所以说每种检测方法都有各自的优势，在选择方面需要针对自己的实际需求来选择。
15、诊断试剂临床实验由研发单位开展是否可行？国家政策依据。（夏应菊，中国兽医药品监察所）
答：针对诊断试剂临床试验方面我们对于临床样品的数量有要求，对于临床试验中需要涉及多少家单位是没有要求的。对于研发单位通常是不能作为临床试验单位的。
16、诊断制品开展临床实验暂时没有GCP的要求吧？是否有国家政策文件支持。（夏应菊，中国兽医药品监察所）
答：我们要求需要开展临床试验的单位必须跟有开展临床试验资质的单位先签订协议，对于临床试验资质方面，不一定需要GCP，只要能够满足能提供足够数量的临床样品即可开展。
17、对于疾病的诊断，是不是有了分子生物学诊断方法以后，对于临床诊断和病理诊断这些环节就可以跳过？（莫妮克·弗朗卡，佐治亚大学）
答：疾病的诊断是一个系统的过程，没有一种方法是确诊的，在疾病诊断的过程中应该全面而系统的运用多种检测方法才能得出相对精准的诊断结果。
18、针对目前猫、狗、水貂等均可以感染新冠，而这些动物与我们人类的生活密切相关，为此在动物领域开发新冠疫苗有必要吗？（琳达·塞夫院士，俄亥俄州立大学）
答：是否有必要做，取决于两个方面，第一方面看动物感染的数量、程度、范围，这些内容需要更多的数据和证据来证明开发动物用新冠疫苗的重要性；第二方面现在已经有2例新冠可以从感染的水貂感染人类的案例出现，这提醒我们需要有更多的数据来监测新冠从宿主再传回人类的可能性，所以现在谈论这个问题还为时过早。
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