技术支撑 | 猪急性腹泻综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用
来源：司广斌等 中国动物检疫 2020-11-21 14:24:55| 查看：
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摘要：为建立一种鉴定猪急性腹泻综合征病毒（SADS-CoV）的RT-PCR方法，根据NCBI登录的SADS-CoV N基因保守区域序列，设计了3对引物（P1、P2和P3），通过对SADS-CoV及其他6种病毒进行检测，筛选出最合适的引物，然后对退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、rTaq DNA聚合酶浓度和循环次数等反应条件进行了优化。结果显示，P3引物对SADS-CoV特异性最好，与其他病毒无交叉反应。敏感性试验显示，该方法最低检测限可达9.55×102copies/μL；重复性试验显示该方法重复性良好。运用建立的RT-PCR方法，对广东省的21份临床样品进行检测，结果检出SADS-CoV阳性样品4份，阳性样品的测序结果与其RT-PCR完全一致。结果表明，本研究成功建立了一种鉴定SADS-CoV的RT-PCR方法，且该方法具有检测快速、成本廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点，可以用于SADS-CoV的临床诊断。
2017年2月，广东省发生以急性呕吐和水样腹泻为主要症状的哺乳仔猪严重疫情，但临床中均未检测到与猪腹泻相关的病毒。经过病原分离鉴定，最终确认疫情由1种新型猪肠道冠状病毒（swine enteric alphacoronavirus，SeACoV）引起，而该冠状病毒与已报道的蝙蝠冠状病毒HKU-2株具有遗传关系。另一研究也得出同样结论，新型病毒与HKU-2株具有较高的氨基酸同源性（＞90%），并将其命名为猪肠道α冠状病毒（porcine enteric alphacoronavirus，PEAV），随后，Zhou等将其命名为猪急性腹泻综合征病毒（swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV）。
SADS-CoV属于冠状病毒科alpha冠状病毒属，是一种有包膜的、单股正链RNA病毒。其基因组大小约为2.7kb，包含9个开放阅读框（ORFs），分别是非结构多聚蛋白ORF1a和ORF1b，结构蛋白Spike（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），以及辅助蛋白NS3a、NS7a和NS7。电镜下观察，病毒颗粒直径为100~120nm，具有典型的冠状病毒表面投影。目前尚无证据表明SADS-CoV能够感染人类，但可感染蝙蝠、小鼠、大鼠、沙鼠、仓鼠、猪、鸡等非灵长类动物和人类等多种细胞系，所以监测该病毒是否具有跨物种传播的潜在威胁就显得尤为重要。2017年，SADS-CoV造成广东省24693头仔猪死亡，2019年，SADS-CoV再次暴发，造成约2000头仔猪死亡。2018年，福建省也相继发现了SADS-CoV，表明病毒感染的范围正逐步扩大，对养猪业造成了严重威胁。人工感染试验表明，SADS-CoV对新生仔猪具有高致病性，可以引起新生仔猪腹泻，并且出现明显的肠道损伤。SADS-CoV既可单独感染，也可与猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和轮状病毒（rotavirus，RV）混合感染，所以建立一种简便、快速的SADS-CoV检测方法尤为重要。
RT-PCR检测方法因其快速、简便、特异性好和灵敏度高等特点而被广泛应用。本研究根据SADS-CoV的N基因，建立SADS-CoV的RT-PCR检测方法，并使用该方法进行SADS-CoV的快速筛选和疾病监测，以期为SADS-CoV的流行病学调查提供技术支持。
将肠道组织样品剪碎，加入PBS缓冲液充分研磨，反复冻融3次后8000 r/min离心10min；取200μL上清液，参照RNA提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，-80℃保存备用；用反转录试剂盒，将提取的RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。
用MEG6.0对GenBank收录的12条SADS-CoV全基因组序列进行比对，根据其保守区域N基因，用Primer 5.0软件设计3对特异引物P1、P2、P3（表1）。以SADS-CoV、TGEV、PDCoV、PEDV、PRRSV、SVV和PTV等病毒的cDNA为模板，分别用上述3对引物在同等条件下进行PCR扩增，从中选出特异性强、扩增效率高的引物，用于SADS-CoV RT-PCR检测方法的建立。
以SADS-CoV阳性cDNA为模板，使用特异性检测引物进行PCR扩增；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收目的片段；将目的片段克隆至pMD19-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养8h；用质粒提取试剂盒提取重组质粒，送睿博生物有限公司测序验证。
以无核酸酶的水为模板作为阴性对照。以上为初始PCR体系组成部分及反应程序。通过优化单一变量，其他条件不变，针对先行优化的反应条件，选择出最优结果后，直接将其运用到下一反应条件继续优化。所有优化条件的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，在凝胶成像系统上观察结果，以最亮的靶条带作为最优结果。
退火温度优化。固定其他条件不变，设置44、46、48、50、52、54、56和58℃共8个温度梯度，应用上述反应条件分别进行PCR扩增。
引物浓度优化。筛选出最佳退火温度后，固定体系内其他变量，进行引物浓度优化。设置0.04、0.08、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32和0.36μmol/L共8个引物混合浓度梯度，应用上述优化后反应条件分别进行PCR扩增。
rTaq DNA聚合酶浓度优化。设置0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14和0.16U/μL共8个rTaq DNA聚合酶浓度梯度，应用上述优化后反应条件分别进行PCR扩增，根据扩增效果确定最佳浓度。
dNTPs混合物浓度优化。设置0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35和0.40mmol/L共8个dNTPs混合物浓度梯度，应用上述优化后反应条件分别进行PCR扩增，确定最优浓度。
循环次数优化。设置15、20、25、30、35、40共6个循环次数梯度，应用上述优化后反应条件分别进行PCR扩增，确立最佳循环次数。
测定重组质粒浓度并换算成拷贝数，对其进行10倍系列稀释后，分别作为模板，利用优化后的RT-PCR进行扩增，确定该方法的敏感性。
分别提取不同批次的3个阳性样品，每个样品3个重复，进行3次重复测定，验证RT-PCR的可靠性。
使用RNA提取试剂盒提取21份病料样品总RNA，利用建立的RT-PCR方法进行检测，并以SADS-CoV提取的RNA作为阳性对照。RT-PCR产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
以SADS-CoV的阳性质粒、TGEV、PDCoV、PEDV、PRRSV、SVV和PTV等病毒的cDNA为模板，同时以无菌水做阴性对照，分别用P1、P2和P3引物对扩增，扩增产物分别为356、313和316 bp（图1）。3对引物对中，只有引物对P3能够特异性地以SADS-CoV cDNA为模板扩增出316 bp的单一目的条带，并且其他病毒cDNA均无特异性扩增条带。由此可知P3引物对特异性好，因此选择P3引物对作为本研究的扩增引物。
退火温度优化。固定其他试剂浓度及反应条件不变，对特异性引物的退火温度进行优化，随着退火温度升高，目的条带亮度先增强然后逐渐减弱，在退火温度为52℃时，电泳条带最亮，扩增效率最高（图2-A）。
引物浓度优化。在上述最佳退火温度下，通过对上、下游引物不同浓度的优化，确定当上、下游引物浓度各为0.28μmol/L时，扩增效率最高（图2-B）。
rTaq DNA聚合酶浓度优化。设置8个rTaq DNA聚合酶浓度，当rTaq DNA聚合酶浓度为0.12U/μL及以上时，扩增效率趋于一致，条带无显著性差异。因此确定最佳rTaq DNA聚合酶浓度为0.12U/μL（图2-C）。
dNTPs浓度优化。通道5~8均拥有相等亮度的目标条带（图2-D），因此确定最佳dNTPs浓度为0.25mmol/L。
循环次数。随PCR反应循环次数增加，目标条带亮度逐渐增加，当循环次数为35和40时，条带亮度趋于一致，因此最佳循环次数确定为35（图3）。
利用分光光度计测定重组质粒浓度为31.5ng/μL，换算为拷贝数9.55×109copies/μL。将重组质粒进行10倍倍比稀释后作为模板，利用建立的RT-PCR方法进行检测。结果显示，该方法最低检测限可达9.55×102copies/μL（图4）。
以SADS-CoV cDNA为模板，同一批次选取3个样品，进行3次重复性检验。结果显示（图5），9次扩增产物的电泳条带大小、亮度均一致，表明该方法重复性良好。
将21份临床样品进行RNA提取后反转录为cDNA，再用RT-PCR方法进行检测，检测结果（图6）显示阳性4份、阴性17份，阳性率为19.05%（4/21）。将SADS-CoV阳性样本的扩增产物进行测序，证实目的条带均为SADS-CoV N基因的特异性片段。测序分析结果和RT-PCR结果完全一致，进一步验证了建立的RT-PCR检测方法的特异性和准确性。
SADS-CoV是2017年在广东省发现的一种新型猪肠道冠状病毒，且已在广东省引起了两次严重疫情。回顾性调查表明，2016年8月SADS-CoV就已经在猪群中存在，表明SADS-CoV在广东省已经存在较长一段时间。截至目前，该病还未在其他国家发现，因此需要进行适当规划和实施来防止SADS-CoV跨境传播。由于该病症状与其他病毒造成的腹泻相似，因此在临床检测中仅凭临床症状很难区分，使得诊断具有挑战性，需要借助实验室诊断。基于TaqMan和SYBR染料的实时荧光RT-PCR方法已经被用于SADS-CoV检测，但是该方法的应用受到qPCR仪器限制。实时逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）检测SADS-CoV的方法也已经建立。该方法可以用于SADS-CoV快速检测，但是相关酶的价格昂贵，不适用于大量样品检测。为避免SADS-CoV的广泛流行及减少相应经济损失，开发一种适用于大多数常规实验室的高灵敏度检测方法具有重要意义。
RT-PCR技术是一种成熟的核酸扩增技术，自发明以来在病毒检测中得到了广泛应用。目前，该方法在动物病毒检测中仍发挥着重要作用，如诺如病毒和TGEV等。该方法具有耗时短、特异性好、灵敏度高、成本低等优点，而且可以与基因测序相结合，通过排除错误扩增的产物来确认SADS-CoV核酸的存在，从而证实SADS-CoV感染。此外，扩增产物区域的任何保守突变都可以用于对分子流行病学研究。这种方法也允许回顾性的流行病学追踪。本研究建立了一种RT-PCR方法，可用于检测流行地区猪肠道组织和粪便样本中的SADS-CoV。
N基因是SADS-CoV序列中保守的区域，本试验比对了SADS-CoV的N基因，设计了3对引物，从中筛选出最佳特异性扩增引物P3，用于建立SADS-CoV RT-PCR检测方法。随后，对反应条件和反应体系进行了优化，包括退火温度、引物浓度、rTaq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度和循环次数。5种反应条件的优化使该方法敏感性提高，成本降低，也避免了添加多余成分造成的不利影响和不必要浪费。SADS-CoV RT-PCR方法检测限量可达9.55×102copies/μL；并且样品的批内和批间重复性试验均能良好地扩增出目的条带，表明重复性良好。同时，对临床检测为阳性的样品进行测序分析，发现测序结果与GenBank已发表核苷酸序列同源性为100%，进一步验证了该方法的可靠性。因此，本研究建立的RT-PCR方法快速、灵敏、可靠、经济，可用于实验室猪肠道组织和粪便样本中SADS-CoV检测、SADS-CoV感染监测以及流行病学研究。
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