切片的厚度 一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也较好一些，由于切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同时膜结构也较多，防止扩增产物弥散的作用也越明显。但厚切片细胞重叠多，形态学观察的效果就差了，分辨率也将下降。
 

　　玻片的处理 为防止石蜡切片在PCR和原位杂交过程中脱落，在玻片应作防脱片处理，常用的方法是涂以多聚赖氨酸或用硅烷化处理，一般能防止组织脱落。
 

　　蛋白酶的消化作用 在进行原位扩增之前，组织标本需经蛋白酶处理。经蛋白酶消化的组织细胞，可增加其通透性，充分答应反应体系中的各成分进进细胞内，并能很好的暴露靶序列，以利于扩增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根据组织固定的程度进行调整。蛋白酶消化后，要留意加热以灭活酶的活性或通过充分的洗涤将酶完全往除，由于只要有少量的残留酶存在，都将对随后进行的PCR反应体系的数目TaqDNA酶产生毁灭性的影响。
 

　　蛋白酶消化处理组织细胞可进步通透性，有利于后续进行的各反应成分进进细胞内或核内，但同时也使得扩增产物的弥散机会增多，有可能带来假阳性或假阴性的结果。
 

　　原位扩增(PCR)
 

　　原位扩增即在组织细胞标本上进行PCR反应，其基本原理与液相PCR完全相同。
 

　　引物 PCR所用的引物一般为15-30bp为宜，扩增的片断为100-1000bp左右。原位PCR宜用较短的引物。从石蜡切片中提取的DNA很少超过400bp，RNA很少超过200bp，较长序列的扩增易引起引物与模板的错配而导致非特异性反应的出现。
 

　　反应体系 原位PCR的反应体系与常规的液相PCR基本相同，由于是在经过固定的组织切片上进行，为获得较好的扩增效果，有人主张反应体系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的浓度均应高于液相的PCR反应体系。在反应体系中要加进牛血清白蛋白(BSA),以防止TaqDNA聚合酶与玻片的结合而降低了扩增效率。
 

　　热循环 原位PCR的热循环可在专门的热循环仪上进行，操纵简便。也可在一般的PCR热循环仪上进行，通常在样品台上覆盖一层铝箔，制成平台，样品台上的空间用矿物油或水充填，将载玻片至于平台上，即可进行热循环的步骤。
 

　　为了保证进行充分的扩增，原位PCR热循环中每一步骤的时间可比常规PCR略长些，另外，也可采用热启动(hot start)的方法，即玻片加热到80-94℃时，再立即加进TaqDNA聚合酶。
 

　　为了保证反应体系在热循环过程不过多丢失，可用清亮的指甲油，矿物油或PAP笔把盖片四周封闭起来。
 

　　洗涤 原位扩增结束后，标本应清洗，以除往弥散到细胞外的扩增产物。洗涤不充分，会导致扩增产物在检测时显现，造成背景过深或假阳性结果的出现。但是，洗涤过度，也会造成细胞内扩增的产物被洗脱，是阳性信号减弱或丢失。
 

　　有作者在扩增后用4%多聚甲醛2小时或2%戊二醛5分钟进行后固定，以使扩增的产物在检测时能很好地保存在细胞内，进步检测的敏感性和特异性。
 

　　原位检测
 

　　原位PCR的扩增产物检测方法，取决于原位PCR的设计方案，直接法则根据标记分子的性质对扩增产物直接进行原位检测。间接法则需用原位杂交的方法进行检测。
 

　　荧光素、生物素、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的检测，与免疫组织化学技术和亲和组织化学技术相同，详见前述。

　　原位PCR技术的应用
 

　　原位PCR技术的突出上风，就是能在组织细胞原位检测出拷贝数较低的特异性基因序列。按照待测基因的性质，可将原位PCR的应用分为检测外源性基因和内源性基因两方面。
 

　　1、用于外源性基因的检测
 

　　(1)病毒基因的检测
 

　　感染病毒的细胞常无较好的检测手段，但当原位PCR技术应用后，使这一极为困难的题目有看解决。
 

　　对HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多种病毒的检测，使我们能够成功等观察到这些病毒在艾滋病、生殖系统肿瘤、肝炎及肝癌中的作用，能够及时发现受感染的人群。
 

　　(2)细菌基因的检测
 

　　最突出的应用是在结核杆菌的检测上，当结核病变不够典型时，经过特殊染色的方法(详见第一篇第五章)很难在镜下找到结核杆菌，而应用原位PCR技术可帮助明确诊断，当结核杆菌很少时仍能在镜下被很轻易地找出来。
 

　　(3)导进基因的检测
 

　　在转基因动物的研究中，是否导进了基因，在接受基因治疗的患者体内，是否接受了导进的基因，均可用原位PCR技术来证实。因此，原位PCR技术成为重要的检测手段。
 

　　2、 用于内源性基因的检测
 

　　(1)异常基因的检测
 

　　机体内基因的突变、重排、也可用原位PCR技术进行检测，原癌基因，抑癌基因的突变，恶性淋巴瘤免疫球蛋白重链基因的重排，对肿瘤的研究和诊断无一均提供了广阔的应用远景。
 

　　(2)固有基因的检测
 

　　对于机体细胞内只有单个或几个拷贝的低表达固有基因，原位杂交技术因基因拷贝数太少而无能为力，液相PCR虽可进行扩增检测出来，但不能确定含有该基因的细胞类型，原位PCR技术则弥补了上述两种技术的不足，使得我们能够对人类各种基因进行检测，而完成人类基因图的绘制。